Для упрощения использования самолёта в малоподготовленных аэропортах важное внимание было уделено механизации крыла (уменьшение требуемой длины ВПП) и встроенному трапу (для упрощения посадки и высадки пассажиров в случае отсутствия штатного трапа). Двигатели самолёта отличались большим уровнем шума, что создавало проблемы эксплуатантам в первые годы использования лайнера. В поздних модификациях уровень шума был уменьшен.

B-727 был хорошо принят авиакомпаниями и в 1960-х быстро распространился за пределы США, особенно в страны Латинской Америки и Средиземноморья. Для целого ряда авиакомпаний он стал первым типом используемого воздушного судна и основной «рабочей лошадкой» для выполнения сначала регулярных пассажирских, а затем чартерных и грузовых рейсов на среднюю дистанцию. Появление более экономичного двухдвигательного B-737 в конце 1960-х привело к снижению числа заказов на 727-й. Однако даже после нефтяного кризиса 1974 года авиакомпании снова наполнили портфель заказов на этот самолёт, в основном на его грузовые версии. Последний лайнер был поставлен заказчику в 1984 году, большинство крупных авиакомпаний развитых стран вывели из эксплуатации B-727 к началу 2000-х годов.

Вывод на рынок B-727 дал Boeing значительное преимущество перед конкурентами из McDonnell Douglas, которые смогли предложить рынку аналогичный самолёт (MD-80) с большим опозданием, когда привыкшие работать с Boeing авиакомпании уже заказали B-737. Успех последнего во многом был предопределён хорошей реакцией рынка на его предшественника. Другим развитием типа стал Boeing 757, имеющий большие дальность и вместимость, чем B-727 и особенно востребованный грузовыми перевозчиками в качестве замены B-727.